薄層色譜成像分析儀中不同溶劑對(duì)樣品的洗脫能力不同，因此在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)開始呈環(huán)形展開，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)，Kaiser稱這種現(xiàn)象為“點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。這種效應(yīng)對(duì)隨后的線形展開造成不良影響，因此配制樣品溶液時(shí)應(yīng)選用對(duì)組分溶解度相對(duì)較小的溶劑；溶劑的粘度不宜過(guò)高，以便于點(diǎn)樣，溶劑的沸點(diǎn)要適中，沸點(diǎn)過(guò)低由于揮發(fā)會(huì)改變樣品溶液濃度導(dǎo)致較大誤差，沸點(diǎn)過(guò)高，樣品溶液的溶劑會(huì)在原點(diǎn)殘留，導(dǎo)致改變展開劑的選擇性，特別是樣品溶液的溶劑與展開劑的極性相差較大時(shí)更為明顯，zui常用的溶劑為甲醇及乙醇，有時(shí)也用丙酮。點(diǎn)樣后必須將溶劑全部除去后再進(jìn)行展開，但要避免高溫加熱，以免改變待測(cè)成分的性質(zhì)。

    薄層色譜成像分析儀點(diǎn)樣方式、點(diǎn)樣量及點(diǎn)樣設(shè)備的選擇決定于分析的目的、樣品溶液的濃度及被測(cè)物質(zhì)的檢出靈敏度。

   點(diǎn)樣體積經(jīng)典薄層一般為1-5μl，薄層為100-500nl，樣品溶液濃度一般在0.01%-1.00%范圍內(nèi)，點(diǎn)樣過(guò)多會(huì)造成原點(diǎn)“超載”，展開劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象使斑點(diǎn)拖尾或重疊，使掃描峰形不對(duì)稱或不能基線分離，并由于超載得到非線性的校正曲線，嚴(yán)重影響定量結(jié)果，降低準(zhǔn)確度。
    經(jīng)典薄層的原點(diǎn)直徑zui大不得超過(guò)5mm，一般3mm較為合適，薄層原點(diǎn)直徑約為1-2mm，盡可能避免多次點(diǎn)樣，原點(diǎn)直徑過(guò)大會(huì)降低分辨率及分離度。
    經(jīng)典薄層色譜成像分析儀中薄層起始線距底邊約1.5cm，薄層為1cm，展距前者為10-15cm，后者為5-7cm，對(duì)于難分離的化合物用多元展開劑展開時(shí)，注意原點(diǎn)與展開劑的距離每次要保持一致，否則由于色譜分離zui初行為的差異而導(dǎo)致分離失敗。
    點(diǎn)與點(diǎn)的間距經(jīng)典薄層為1-2cm，薄層為0.5cm，用具自動(dòng)換行功能的薄層掃描儀時(shí)，斑點(diǎn)之間的距離必須十分，才能正確地掃描每行的色斑，得到好的測(cè)定結(jié)果，圖7-3-1為一般的點(diǎn)樣圖解。

    在點(diǎn)樣前，應(yīng)將薄層板在日光及紫外光下檢查板面有無(wú)損壞或污染，選擇合格的薄層板后決定用點(diǎn)狀點(diǎn)樣還是用帶狀點(diǎn)樣。為此，瑞士CAMAG公司生產(chǎn)了系列點(diǎn)樣設(shè)備以供選用，這些設(shè)備只適用于硬板。下面是常用的點(diǎn)樣方式及設(shè)備。 北京威鋒技術(shù)開發(fā)公司 
（一）點(diǎn)狀點(diǎn)樣
    如果薄層色譜成像分析儀僅僅為了定性，用內(nèi)徑約0.5mm管口平整的毛細(xì)管或微量注射器將樣品溶液點(diǎn)在距薄層底邊約2cm處，點(diǎn)樣直徑不超過(guò)5mm，點(diǎn)間距約為1-1.5cm即可。
    為進(jìn)行定量，借毛細(xì)作用吸樣的定容管有兩種，一是容積為0.5、1、2、3、4及5μl的定量毛細(xì)管（Microcaps），另一種是100及200nl的鉑銥合金定量毛細(xì)管（Nanopipette）；注射器式的可變體積的點(diǎn)樣器有50-230nl的毫微點(diǎn)樣器（Nano-Applicator）及0.5-2.3μl的微量點(diǎn)樣器（Micro-Applicator），用于需要調(diào)節(jié)體積及沒(méi)有毛細(xì)作用的鍵合相薄層的點(diǎn)樣。
    毛細(xì)管式的微量點(diǎn)樣器裝在手動(dòng)的Nanomat型點(diǎn)樣裝置的磁性點(diǎn)樣頭上，點(diǎn)樣頭裝在彈簧上。按下此點(diǎn)樣頭，毛細(xì)管借恒定的壓力接觸薄層表面。點(diǎn)間距離由帶準(zhǔn)確的#44 間隔的E字形缺刻裝置控制，適用于普通或薄層板，點(diǎn)樣體積，樣品原點(diǎn)小，原點(diǎn)間隔定位準(zhǔn)確；注射器式的毫微點(diǎn)樣器及微量點(diǎn)樣器由測(cè)微尺控制，也可與Nanomat型點(diǎn)樣裝置配合，以使點(diǎn)樣位置。
    電動(dòng)點(diǎn)樣裝置*適用于上述各種點(diǎn)樣器的配套使用，并且還可以自動(dòng)控制點(diǎn)樣次數(shù)，點(diǎn)樣器在薄居上的停留時(shí)間，以及點(diǎn)樣器接觸薄層的速度。還可避免手持毛細(xì)管點(diǎn)樣時(shí)的用力不勻，由于靠機(jī)械控制接觸板面，壓力恒定。此外，還有可以用于環(huán)形展開及向心展開的薄層點(diǎn)樣裝置。
（二）帶狀點(diǎn)樣
    當(dāng)樣品溶液體積大、濃度稀時(shí)，采用自動(dòng)點(diǎn)樣設(shè)備進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣。定量分析的點(diǎn)樣范圍為1-99μl，制備型分離點(diǎn)樣范圍為5-490μl，作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可由同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，自動(dòng)點(diǎn)上不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液，故快速簡(jiǎn)便，利用內(nèi)裝的微處理器編序操作，簡(jiǎn)單易行。使用時(shí)樣品溶液吸在微量注射器中，點(diǎn)樣器不接觸薄層，而是用氮?dú)鈱⒆⑸淦麽樇獾娜芤捍德湓诒由?，薄層板在針頭下定速移動(dòng)點(diǎn)成0-199mm的窄帶。帶狀點(diǎn)樣展開后的斑點(diǎn)不僅分辨率明顯高于點(diǎn)狀點(diǎn)樣，而且精密準(zhǔn)確，為定量分析提供*條件。
（三）自動(dòng)點(diǎn)樣
    全自動(dòng)點(diǎn)樣裝置結(jié)合了現(xiàn)代的電子及機(jī)械技術(shù)，能進(jìn)行點(diǎn)狀或帶狀點(diǎn)樣，采用先進(jìn)計(jì)算機(jī)編程控制，靈活多用，點(diǎn)樣量為10nl-50μl，可隨意設(shè)定點(diǎn)樣規(guī)范，可應(yīng)用于單向、雙向、環(huán)形或向心色譜展開，高度自動(dòng)化的點(diǎn)樣使定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。點(diǎn)樣參數(shù)可與Scanner Ⅱ掃描儀的CATS掃描分析軟件連用，令定量分析工作達(dá)到高度自動(dòng)化。
（四）接觸點(diǎn)樣
    當(dāng)樣品溶液粘度較大或點(diǎn)樣體積要超過(guò)100μl時(shí)，用毛細(xì)管點(diǎn)樣就有困難，F(xiàn)enimore設(shè)計(jì)的接觸點(diǎn)樣法適用于這類樣品的點(diǎn)樣，美國(guó)制造的Clarke Contact Spotter就是這種接觸點(diǎn)樣器，見圖7-3-2。在帶有抽氣孔的凹形塊的上方覆蓋一片涂有疏水性物質(zhì)的聚氟化物薄膜（a），當(dāng)減壓抽氣時(shí)薄膜凹陷（b），此時(shí)將樣品溶液點(diǎn)在凹槽處（c），然后用氮?dú)獯等ゴ蟛糠秩軇╠），再將濃縮后的樣品液滴與薄層板的吸附劑層接觸（e），此時(shí)樣品就定量地轉(zhuǎn)移到薄層上。

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    1988年Kaiser對(duì)以上各種點(diǎn)樣方式進(jìn)行了比較，總結(jié)其優(yōu)缺點(diǎn)見表7-3-1、圖7-3-3。

表7-3-1 各種點(diǎn)樣方式的比較北京威鋒技術(shù)開發(fā)公司

    圖7-3-3中A-F為zui常用的毛細(xì)管或注射器點(diǎn)樣：A—一次性數(shù)毫米長(zhǎng)的薄壁玻管；B—長(zhǎng)5-60mm，內(nèi)徑為0.2-0.05mm的熔融石英管，用機(jī)械手操作；C—封在玻璃管中的鉑銥合金管（100nl,200nl），可點(diǎn)樣，生物樣品點(diǎn)樣后可用火焰清潔，見圖7-3-4；E—微量注射器，機(jī)械控制，接觸板面點(diǎn)樣；F—同E，用步進(jìn)馬達(dá)控制操作；G—同E，樣品溶液用氣體噴到薄層板上；H—同E，*用計(jì)算機(jī)控制點(diǎn)樣；I、K、L—借泵系統(tǒng)點(diǎn)樣，用于高壓平面液體色譜（HPPLC）；M—為Fenimore的固態(tài)樣品環(huán)形轉(zhuǎn)移器。

    用管狀點(diǎn)樣器上樣的誤差來(lái)源是由于點(diǎn)樣時(shí)薄層表面的損傷，溶液“爬壁”效應(yīng)使外壁樣品的沉積、樣品的記憶效應(yīng)以及管中的微小氣泡等，見圖7-3-5。
    點(diǎn)樣誤差的大小與樣品的溶解度，溶液的表面張力，溶劑的粘度、揮發(fā)性和極性、點(diǎn)樣所耗費(fèi)的時(shí)間、薄層板的質(zhì)量（粒度、均勻度、薄層厚度、粘合劑的性質(zhì)）等有關(guān)。
（五）特殊的點(diǎn)樣技術(shù)
    在進(jìn)行植物成分薄層分離之前，提取是首要的步驟，常用適當(dāng)溶劑進(jìn)行待測(cè)物質(zhì)的提取，但此法操作麻煩、樣品需要量較大，濃縮提取液時(shí)對(duì)熱不穩(wěn)定的成分易破壞，因此人們研究了樣品不經(jīng)提取而直接點(diǎn)樣的方法。
1.熱微量抽出法
    半個(gè)世紀(jì)前，人們將一些藥物進(jìn)行微量升華，對(duì)升華物進(jìn)行晶型、熔點(diǎn)以及理化性質(zhì)等鑒定。在zui簡(jiǎn)單的情況下，只需將幾毫克生藥粉末放在微量載玻片上加熱，升華物被收集到距離放樣品載玻片1mm的另一塊載玻片上。1968年Stahl將熱微量分離轉(zhuǎn)移技術(shù)與薄層色譜法連用，稱為“熱微量抽出法”此法的優(yōu)點(diǎn)是大大縮短了提取生藥中揮發(fā)性成分前處理的時(shí)間，簡(jiǎn)化了提取方法，減少了樣品用量，缺點(diǎn)是不宜用于非揮發(fā)性成分。
    將植物粉末樣品放在一端拉細(xì)的玻璃管中，并同時(shí)放入含有一定水分的合適添加劑，使加熱過(guò)程中保持連續(xù)的水蒸氣流（在TAS法中除用含水的分子篩作中性發(fā)氣劑外，還可用酸性發(fā)氣劑，如丙二酸，在180℃時(shí)產(chǎn)生二氧化碳和乙酸，能使樣品中的堿性揮發(fā)性成分以鹽的形式保留而不逸出，而酸性揮發(fā)性成分隨酸性氣體轉(zhuǎn)移到薄層上；反之亦可用堿性發(fā)氣劑，如含氨的氯化鈣，使樣品中的堿性成分隨氨氣轉(zhuǎn)移到薄層上），管的一端用硅橡膠薄膜嚴(yán)密封閉，并放置在一定溫度的TAS爐上，裝置見圖7-3-6。

加熱至220℃，揮發(fā)性成分氣化，并從玻璃管一端的毛細(xì)管口逸出，管中同時(shí)以30ml/min的氮?dú)饬鲙椭鷵]發(fā)性成分逸出，逸出的氣化成分點(diǎn)加到離出口處1mm的薄層上，待上樣完畢，按常規(guī)方法展開，即可獲得熱餾分色譜圖。
    Stahl和Lott發(fā)展了此法，設(shè)計(jì)了可以一定速度橫向移動(dòng)的薄層板裝置，可使受熱后揮發(fā)性成分或熱分解產(chǎn)物附著在移動(dòng)的薄層板起始線上，加熱方式可以恒溫或程序升溫，從而可以得到各種樣品的特征譜，改進(jìn)后的方法稱為熱分級(jí)色譜法。圖7-3-7為用市售的“TASOMAT”裝置得到的特征圖譜。

    這種微量快速的上樣方法，對(duì)天然化合物及合成高分子化合物的分離和鑒定已成為一個(gè)重要的手段。下村等在中藥厚撲鑒別的研究中應(yīng)用了此法，只需少量樣品即可鑒別厚撲酚（honokiol）；橋本庸平等用此法分離了的旋光異構(gòu)體，管內(nèi)殘?jiān)?jīng)生物堿檢查呈陰性，證明加熱后的揮發(fā)是*的。Jolliffe等將含有某些生物堿的藥物，如烏頭、檳榔、顛茄、金雞納、麥角、曼陀羅、天仙子、蘿芙木、番木鱉等31種植物藥進(jìn)行熱微量抽出法，逸出的揮發(fā)性成分直接點(diǎn)在薄層上，用五種不同展開劑展開，用羅丹明B及奶油黃為參比物，顯色后對(duì)所分離的生堿進(jìn)行鑒定。Cheml等將金雞納樹皮中的生堿在爐溫300℃時(shí)揮發(fā)至硅膠板上，展開后鑒定辛可寧等七種生堿。Van Meer等成功地用本法分離了纈草根中的纈草素及異纈草素。Liptak等用本法檢驗(yàn)洋茴香、洋甘菊和歐薄荷以及它們的精油類成分。
    中成藥組成復(fù)雜，藥典收載的中成藥薄層色譜鑒定法均系用溶劑提取后和單味藥材或單一成分進(jìn)行對(duì)照。曾美怡等試用熱微量轉(zhuǎn)移法鑒定中成藥，方法簡(jiǎn)述如下：
    成方制劑的處理：蜜丸拌以等量硅膠5；片劑研成細(xì)末；膠囊劑和散劑不加處理；油劑可點(diǎn)在硅膠板上，然后將硅膠連油刮下。
    熱微量轉(zhuǎn)移條件將樣品裝入用鋁箔卷成的細(xì)筒，加一粒含水分子篩，置加入管內(nèi)，于220-225℃加熱60-90s。樣品中的揮發(fā)性、熱分解或升華性成分即直接轉(zhuǎn)移至薄層上。
    定位用茴香醛試劑或用熒光法。
    樣品用量成方制劑為10-16mg，單味藥為4-8mg。受試樣品有冠心蘇合丸、復(fù)方丹參片、七厘散、銀翹解毒丸、六味地黃丸等成方及單味藥，進(jìn)行了成功的探索，其優(yōu)點(diǎn)是不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前處理即可得到可供鑒別的色譜。此外，本法也可以應(yīng)用于小量生藥的半定量分析，生藥成分的微量制備以及生藥的指紋鑒定等。
2.流體提取法
    在臨界壓力和臨界溫度以上相區(qū)內(nèi)的氣體為超臨界流體，此時(shí)氣體的密度、介電常數(shù)和溶劑樣性質(zhì)均顯著增加，見圖7-3-8。物質(zhì)在超臨界流體中的溶解度由于壓縮氣體與溶質(zhì)分子間相互作用加強(qiáng)而大大增加。

    改變溫度和壓力就可改變超臨界流體的特性，因此可以分別在一定溫度和壓力條件下將不同極性的成分從樣品中提取出來(lái)，這種方法與薄層色譜聯(lián)用，稱流體提取一薄層色譜法（Fluid extraction-TLC,FE-TLC）。
    用于這種提取過(guò)程的氣體有二氧化碳、氧化亞氮、乙烯、三氟甲烷、六氟化碳、氮?dú)?、氬氣等。?-3-2中列出了各種氣體在臨界點(diǎn)的物理參數(shù)。其中二氧化碳是zui常用的一種氣體。

表7-3-2幾種氣體的物理參數(shù)

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    圖7-3-9為FE-TLC示意圖，從高壓氣瓶1出來(lái)的氣體，通過(guò)電動(dòng)隔膜壓縮器6壓至7.0-40MPa，壓縮器和微量萃取器12在恒溫器內(nèi)保持恒溫。萃取器的體積為2ml，被萃取樣品置在其中。先關(guān)閉閥門11，待高壓提取器內(nèi)氣壓達(dá)到提取壓力，提取過(guò)程達(dá)到平衡后即打開。超臨界流體通過(guò)一毛細(xì)管噴出。由于氣流壓力下降至大氣壓，帶出的提取物析離并吸附在薄層板13上，薄層板與毛細(xì)管出口間距離為1-5mm。點(diǎn)樣后按薄層常規(guī)方法操作。通過(guò)分步提高提取壓力，可以分步提出不同成分。

    Stahl以二氧化碳為提取氣體，研究了不同化合物的可提取性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，烴類和親脂性化合物，如酯、醚、內(nèi)酯和氧化物等，氣壓達(dá)7.0-10.0MPa即可提取，結(jié)構(gòu)中引入—OH或—COOH基，則提取困難，對(duì)于多羥基酚、多酚基酸、糖和氨基酸等在500個(gè)atm下也不能提出。
    在研究蘿芙木、長(zhǎng)春花、奎寧和等含27種生物堿的提取性時(shí)，選出氧化亞氮為適宜的提取氣體，但提取能力隨生物堿而異。如分離中主要生物堿時(shí)，在約8PMa下和那可汀很易提出，蒂巴因和可待因則較難提出，而嗎啡即使壓力達(dá)20MPa也僅提出極少量。提取一薄層色譜見圖7-3-10及圖7-3-11。

    母菊內(nèi)酯是德國(guó)母菊花的有效成分，極易受熱分解產(chǎn)生藍(lán)色的菊奧 ，因而無(wú)法用水蒸氣蒸餾獲得。用溶劑提取則得率低，如用二氧化碳超臨界流體提取，通過(guò)部分提取的方法，可得到母菊內(nèi)酯及揮發(fā)性含氧化合物，經(jīng)硅膠柱色譜分離即可得到母菊內(nèi)酯結(jié)晶。

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